武汉理工大学土木工程与建筑学院张倩课题组在环境领域一区 top期刊Bioresource Technology上发表了题为“Microbial community and function evaluation in the start-up period of bioaugmented SBR fed with aniline wastewater”的研究论文。

苯胺是苯环上的一个氢原子被氨基取代而形成的一种伯胺。适当浓度的苯胺可以通过生物降解过程有效去除。但由于其特殊的分子结构，苯胺在生物降解后不仅会形成儿茶酚，还会产生一定浓度的氨氮。宏基因组测序技术可以对特定环境下所有微生物的总DNA进行测序，更有利于发现新的物种、基因或生理活性物质。本研究通过成功启动生物增强型反应器高效降解苯胺废水，并利用宏基因组学分析阐明了系统的除污性能、微生物群落和功能。

本研究采用增强型序批式反应器（SBR）处理苯胺（600mg /L）废水。苯胺降解率接近100%，总氮去除率大于50%。宏基因组学技术揭示了强化反应器启动过程中的群落结构、功能基因和代谢机制。测序结果显示， Proteobacteria 、 Bacteroidetes 、 Chloroflexi 和 Actinobacteria 为优势门。芳香族化合物降解功能所占比例逐渐增加，而氮代谢功能所占比例变化不大。

检测到参与苯胺降解的功能基因包括bena - xyx和dmpB/xylE。氮代谢功能基因涉及完全硝化、传统反硝化、同化硝酸盐还原和异化硝酸盐还原。功能贡献分析和网络分析表明， Thauera 、 Delftia 、 Diaphorobacter 、 Micavibrio 和 Azoarcus 的合作和竞争保证了苯胺和氮的有效去除。

苯胺废水主要产生于印染、制药、橡胶等行业。它通常被认为是剧毒且难以生物降解的。并且会对人体和生态环境造成损害。因此，迫切需要一种高效、可持续的苯胺脱除技术。然而，由于苯胺具有很高的生物毒性，在常规生物系统中，除氮细菌等多种微生物的代谢可能会受到抑制。如果苯胺降解过程中产生的氨氮不能被相关功能微生物降解，则会导致水体富营养化或其他环境问题。生物增强处理系统具有启动快、运行稳定、处理效率高等优点，是一种可行的苯胺类废水处理技术。

本研究利用宏基因组学技术研究了强化反应器启动期间苯胺降解的内在机制。本研究的目的是：（1）评价强化反应器对苯胺、COD和各种形式氮的去除性能；（2）研究增强系统启动时的微生物群落结构和代谢途径；（3）基于宏基因组学分析，挖掘苯胺和氮代谢的功能基因和中间体，绘制代谢通路图；（4）探索参与苯胺降解和氮代谢的关键微生物属之间的关系。

   

在启动初期，苯胺和COD的去除率均低于50%。这可能是由于活性污泥尚未适应含苯胺的废水环境，其生物活性较低。然而，在第5天左右，苯胺的去除率很高。稀土对苯胺的降解率几乎为100% （图1(A)）。图1(B)中还可以发现，由于苯胺是唯一的碳源，因此COD的降解趋势与苯胺的降解趋势基本一致。系统稳定运行后，COD去除率达到95%以上。苯胺在生物降解过程中，氨基与芳环之间的键会断裂，释放出NH ₄ ⁺ -N。当苯胺浓度从200 mg/L增加到600 mg/L时，苯胺生物降解释放的NH ₄ ⁺ -N浓度也相应增加，在第7天达到最大值（图1(C)）。

随后，NH ₄ ⁺ -N逐渐降低，基本保持在40 mg/L左右。理论上，600 mg/L苯胺完全降解产生约90.5 mg/L的NH ₄ ⁺ -N，这在一定程度上说明RE具有较强的硝化能力，去除率超过50%的NH ₄ ⁺ -N。而在整个启动过程中，NO ₃ ^- -N和NO ₂ ^- -N的浓度一直很低。从氮平衡的角度来看，反应体系中应该存在一定的反硝化过程。RE对总氮的去除率可达50%以上（(图1(D)），正好证实了反硝化过程的发生。反应器理化指标趋于稳定，表明启动完成。

   

苯胺和COD在前4 h显著降低，NH ₄ ⁺ -N浓度随着苯胺的降解而显著升高。但当未检测到苯胺时，NH ₄ ⁺ -N浓度开始下降。这可能是因为苯胺对反应器内其他微生物的毒性作用暂时得到缓解。整个循环过程中NO ₂ ^- -N的浓度几乎在0.1 mg/L左右。在好氧条件下，NO ₃ ^- -N浓度随NH ₄ ⁺ -N的降低而略有升高。这表明NH ₄ ⁺ - N被部分氨氧化菌氧化为NO ₂ ^- -N，然后NO ₂ ^- -N又被亚硝酸盐氧化菌氧化为NO ₃ ^- -N。

从第6小时开始，反应器停止曝气，随后反应器逐渐进入缺氧状态。之后，NO ₃ ^- -N浓度开始下降。同时，NO ₂ ^- -N浓度接近于0 mg/ L，这可能是还原后的NO ₃ ^- -N和NO ₂ ^- -N通过反硝化作用逐渐转化为气态氮。此外，在整个反应周期中总氮浓度明显处于下降状态，表明生物强化SBR不仅能有效降解苯胺，且能很好地进行硝化和反硝化过程。

   

   

门水平上的微生物群落结构如图3 (A)所示。三个样本中以变形菌门、拟杆菌门、绿杆菌门和放线菌门占优势。变形菌门（ Proteobacteria ）在W1-3中的比例基本保持不变，而拟杆菌门（ Bacteroidetes ）、氯氟菌门（ Chloroflexi ）和放线菌门（ Actinobacteria ）变化显著。拟杆菌门先增加后减少，氯霉素门一直在减少，放线菌门先减少后增加，说明不同门对苯胺废水的适应性随时间的变化而变化。

图3 (B)进一步显示了属水平上的分类展示，仅使用总丰度前50个属进行热图分析。从热图中可以明显看出，W2和W3经过培养后从原始污泥样本W1的聚类树中分离出来。这说明在RE启动过程中，微生物群落组成和结构发生了变化， Thauera 是W2和W3中最占优势的属，且随着时间的推移逐渐增加。 Thauera 从W1的6%增加到W2的23%和W3的37%。 Thauera 通常被报道为典型的反硝化细菌。此外，存在在W1中不存在但在W2和W3中占较大比例的属，这种从不存在到稳定存在的现象说明含苯胺的废水环境有利于这些属的生长。这些主要细菌在RE中的比例平衡很好地维持了反应器环境的稳定性，促进了反应器的成功启动。

   

   

功能预测结果通过比较KEGG数据库揭示了代谢相关通路。将所有样本中丰度小于0.008的函数归为其他函数进行论证（图4(A)）。在三个样品中，所有代谢功能基本相同，丰度差异不明显。

其中，碳代谢、氨基酸生物合成、双组分系统、嘌呤代谢、ABC转运蛋白和群体感应在RE中存在并占主导地位，对维持正常的生命活动至关重要。特别是对于双组分系统和群体感应，它们的存在可以促进微生物更好地适应生存环境，促进种间或种内的交流。三种样品的功能丰度差异不大，这也说明虽然系统中微生物活性受到了一定程度的影响，但微生物代谢系统并未受到破坏。即使在苯胺浓度较高的情况下，整个反应器也能有序进行。

为了进一步解释宏观数据中苯胺和各种氮浓度的变化，我们特别分析了物种对氮代谢(途径ID: ko00910)和芳香化合物降解的贡献分析。如图4(B)所示，不同属对这两种代谢途径的贡献是不同的。值得注意的是， Thauera 对这两种代谢途径的贡献最大。随着反应堆运行时间的延长，其贡献也会越来越大。单就氮代谢而言，除 Thauera 对氮代谢的贡献逐渐增加外， Diaphorobacter 和 Micavibrio 对氮代谢的贡献也逐渐增加。而偶氮菌和 unclassified_d_Bacteria 对氮代谢的贡献明显下降，这在一定程度上说明含苯胺废水对其代谢功能有一定影响。

   

为了揭示对苯胺生物降解和氮代谢贡献最大的属之间潜在的相互作用，图5表示了各种关系模式。总的来说，一个节点（属）拥有的边越多，该细菌拥有的潜在细菌相互作用就越多。红线表示正相关，绿线表示负相关。一般认为，正相关的微生物群落具有合作关系，负相关则反映了一定的竞争关系。

可以看出，这些属之间的亲缘关系基本密切，且丰度越高的属与其他属的亲缘关系越密切。一些关键的苯胺降解和氮代谢属，如 Thauera 、 Delftia 、 Diaphorobacter 、 Micavibrio 和 Azoarcus ，属于变形菌门。

Thauera 、 unclassified_d_Bacteria 、 Delftia 、 Diaphorobacter 、 Micavibrio 三者之间存在正相关关系。与偶氮菌（ Azoarcus ）、脱氯单胞菌（ decchloromonas ）和 unclassified_c_Betaproteobacteria 均呈负相关。 Azoarcus 、 Dechloromonas 和 unclassified_c_Betaproteobacteria 之间呈正相关。然而，在对苯胺生物降解和氮代谢贡献最大的前10个属中， Alicycliphilus 、 Granulicoccus 、 Pseudomonas 和 unclassified_p_Bacteroidetes 与这些属的相关性不明显。以上结果表明，添加到强化SBR中的苯胺降解菌AD1（ Delftia tsuruhatensis ）已与系统中的其他细菌建立了可靠的联系。苯胺废水的有效去除可能取决于这些细菌之间的各种合作和竞争。

     

小结

       

       

本研究成功建立了生物强化SBR反应器，对废水中的苯胺、COD、NH ₄ ⁺ -N和总氮均有较高的去除率。利用宏基因组学分析获得了对去除效率、微生物群落和功能的详细了解。 Thauera 、 Delftia 、 Diaphorobacter 、 Micavibrio 和 Azoarcus 在苯胺的生物降解和氮代谢中起关键作用。随着时间的推移，参与苯胺生物降解的功能基因的丰度不断增加，而脱氮基因的丰度则相反。反应体系中各种功能菌之间的合作与竞争进一步保证了苯胺和氮的高效去除 。