叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素，通过测定水中叶绿素浓度，可掌握水藻类浮游藻类的数量。

下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法. 分别详细介绍了各种方法的设备,程序,计算公式及特点.。此外,还介绍了藻类类胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。 按测定方法分为六个部分：(1) 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法) ; (2) 叶绿素a 的荧光检测法; (3) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的分光光度法测定; (4) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定; (5) 高效液相色谱(HPLC) 测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素。
藻类的特异性色素是叶绿素、叶黄素和胡萝卜素. 浮游藻类里常见的三种叶绿素是叶绿素a ,b 和c.叶绿素a 在一切浮游藻类里大约占有机物干重的1～2 % ,是估计藻类生物量的好指标. 细胞的叶绿素含量随种类或类群而有所不同,同时还受年龄、生长率、光和营养条件的影响.脱镁叶绿素a (一种叶绿素a 的普通降解产物) 能够干扰叶绿素a 的测定,因为如果存在脱镁叶绿素a ,它能在叶绿素a 的相同光谱区吸收光和荧光,造成叶绿素a 值的误差. 当测定叶绿素a 的时候还要测定脱镁叶绿素a. 叶绿素a 和脱镁叶绿素a 之比可作为浮游植物生理条件的一个良好指标.下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法：
(1) 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法) ;
(2) 叶绿素a 的荧光检测法;
(3) 存在脱镁叶绿素a时,叶绿素a 的分光光度法测定;
(4) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定;
(5) 高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素.
1 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法)
用丙酮水溶液自浮游生物浓缩样萃取色素,用分光光度计测定萃取物的吸光度. 叶绿素自细胞内提出的难度,不同藻类差异相当大. 为了将色素完全萃出,通常需要用组织研磨器机械的破坏细胞.
111 　仪器和试剂
(1) 分光光度计:用窄带的(015～210nm) .
(2) 1cm ,4cm 和10cm 光程的比色池.
(3) 医用离心机.
(4) 组织研磨器(最好使用圆底的研磨管和捣杆) .
(5) 离心管:15ml ,有刻度和螺帽.
(6) 过滤设备:过滤器,滤膜(0145μm 孔径,47mm 直径) 或玻璃纤维过滤器(GFPC 或GFPA ,415cm 直径) ,真空泵.
(7)MgCO3 悬浮液:在100ml 蒸馏水中加入110g 细粉末MgCO3 .
(8) 90 %(体积比) 丙酮水溶液.
112 　测定程序
(1) 离心或过滤浓缩水样. 在离心前或过滤的最后一步加入012ml MgCO3 悬浮液.
(2) 把样品置入组织研磨器,用2～3ml 90 %丙酮水溶液覆盖浸泡.
(3) 把样品移入一个有螺帽的离心管,用几毫升90 %丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液
中,用90 %丙酮水溶液调节体积到5～10ml .
(4) 在盖紧的离心管中于500g 离心20min 澄清萃取液,把澄清的萃取液倾入一支清洁的,标定过的15ml 有螺帽的离心管并测定萃取液的总体积.
(5) 把萃取液移入1cm 的比色池,在750、663、645 和630nm 测定吸光度(OD) .
113 　计算
叶绿素a ,b 和c 的测定分别使用663、645 和630nm 的吸光度. 750 nm 的读数用来校正浑浊度. 将每个色素的OD 值中减去这个浑浊度校正值后,带入下列公式计算浓度:
(1) 叶绿素a (mgPl) = 11164 (OD663 ) - 2116 (OD645 ) + 0110 (OD630 )
　叶绿素b (mgPl) = 20197 (OD645 ) - 3194 (OD663 ) - 3166 (OD630 )
　叶绿素c (mgPl ) = 54122 (OD630 ) - 14118 (OD645 ) - 5153 (OD663 )
(2) 各单位体积色素量的计算如下:
叶绿素a (mgPm3 ) = 叶绿素a (mgPl ) ×萃取液的总体积(l) / 水样体积(m3 )
2 叶绿素a 的荧光检测法
叶绿素a 的荧光检测法比分光光度法灵敏,需样品较少. 而且不要求像分光光度法那样的波长分辨率,在430nm 的激发波长和在663nm 的发射波长抽取在试管内测定叶绿素a 可过的最佳灵感度.
211 　仪器和试剂
(1) 荧光计,备有高强度F4 T. 5 蓝光灯,光电倍增管R - 136 (红敏) ,可滑动窗孔,光发射(CS - 2 - 64)
和光激发(CS - 5 - 60) 滤光片,以及一个高灵敏度门.
(2) 其他设备和试剂同111
212 　测定程序
(1) 　用已知浓度的叶绿素溶液标定荧光计:
　用分光光度法测定浓度约为2、6、20 和60μgPl 的叶绿素a 萃取液,再在每一灵敏度位置对每一溶液进行读数,导出标定系数Fs
Fs = CaPRs

水中藻类检测的方法

姓名：田家宇 专业：市政工程 学号：04s027026

本文主要从以下三个方面阐述了水中藻类检测的方法：
1. 藻类检测和计数新方法——置式显微镜法；
2. 改进的水中藻类检测方法；
3.藻类叶绿素及其降解产物的测定方法。
一、藻类检测和计数新方法——置式显微镜法
由于环境污染，一些湖泊富营养化程度不断加剧，导致水中藻类的快速增长。大量藻类的存在，直接影响了自来水的生产和供应。为了了解藻类对水厂各工艺环节的影响，以湖泊水为水源的许多水厂都相继开展了藻类计数检测项目。国内普遍采用的方法是将1L水样加鲁戈试剂固定在一个容器中，自然沉降24h后，利用虹吸的方法吸去上清液，并浓缩定容到30～50mL，然后取1mL放入血球计数板，在正置式显微镜下进行镜检计数[1]。此方法由于所需的水样较多（1L），在需要采集多个水样时，采集和运送的工作量大;在沉样时还要多次冲洗转移，增加了产生误差的机会，而且操作不便。昆明自来水总公司的水源之一是富化程度较高的滇池水，因而昆明水司较早开展了此项目，并得到了瑞士苏黎世供水局的技术支持和大力帮助。我们所采用的藻类计数方法的特点是使用倒置式显微镜，藻样通过沉样板一步沉降到位，与国内普遍采用的方法相比具有准确快捷，水样用量少，运送方便，无须多次冲洗转移，操作简单等优点，适用于生产和科研检测。
1.用品准备
（1）沉样板。由一个长12cm，宽4.1cm,中央有圆形凹槽（底面积为5cm2）的长方形有机玻璃板和一个可滑动的、底部与凹槽形状完全吻合的空心圆筒（容积为25mL）以及一块圆形盖玻片组成（见图1），有机玻璃板的左侧有一小孔，用于放掉上清液。

（2）倒置式显微镜。与普通倒置式显微镜不同的是，它的载物台经简单改造，增加了一个长方形的金属框，大小恰好可放置沉样板。金属框的作用是将沉样板固定在载物台上，使沉样板可与载物台同步移动，避免沉样板发生偏移。两个目镜，一个装有微型刻度尺，可直接测量藻类的大小和长度，另一个装有“ ”形标尺，在讦数时用它界定讦数范围。
（3）250mL试剂瓶。用于盛装水样。
（4）移液管（1～25mL）。
2.药品准备
①鲁戈试剂（Lugols Solution）;②福尔马林（40%）;③洒精（50％）。
3.方法与步骤
3.1取样
先在250mL试剂中加入6～7滴鲁戈剂，再加入200mL，左右水样，摇匀。如果水样需保存较长时间，可加入适量福尔马林（40％）。
3.2沉降
用移液管取适量水样加入沉样板，再加入蒸馏水至满，加盖圆玻片，静沉24h。取多少水样，同藻类的多寡而定，藻类数量多可少取，数量少可多取，一般水样体积在1~25mL之间。
3.3计数
将沉样板上的圆筒用盖玻片推开，放掉上清液，置于显微镜上，以目镜上的“工工”形标尺为界线，随机选取若干条带计数。
一般情况是这样计数的；①在10×16倍镜头下，计数全部视野（1cm2）内的大型藻类。②在×25的倍镜下，随机选取5条带，计数基中的中型藻类。③在10×40倍的镜头下，随机选取1条带，计数其中的微型藻类。
在实际运用中，可根据当地的原水藻类情况，确定所选取的条带数。
3.4计算
N=
式中N ——1mL;
5——沉样板板底部圆形凹槽的底面积，cm2;
S——每个计数条带的面积，cm2;
A——选取的条带数；
V——水样体积；mL;
N——实际数的A个条带的藻类个数。
将上述三个放大倍数下计数得的藻类依上式分别计算，再相加，即得到藻类总数。
3.5清洗
计数完毕，用蒸留水冲洗沉样板，浸泡于50％的酒精中过认，再次用蒸留水冲洗后，晾干待用。
4.注意事项
（1）沉样前，要将水样摇匀
（2）将沉样板的圆筒推开时，要防止产生气泡。
（3）将沉样板置于显微镜上时，要尽量保持平衡，避免藻类向一侧倾斜。
（4）在选取计条带时，既要注意随机性，又要注意均匀性。
5.实际样品检测
取某水厂原水用上述方法（简称倒置法）和国内普遍采用的传统方法（简称正置法）分别进行藻类检测和计数，结果见表1。

由表1可见，倒置法水样用量少，并有较高的精密度；正置法水样用量多，精密度较低，而且由于正置法使用的血球计数的容积所限（0.1m3），出现在计数框内的藻类种类也有限，如果需要分类计数，有一定局限性，不好操作。倒置法可以一边分类鉴定，一边分类计数，水样中存在的种类在1cm2的计数范围内基本都能看到，分类鉴定和计数的结果比较全面，操作也方便。另外，倒置法将水样一步沉降到位，省略了许多中间环节，减少了多次冲洗 转移带来的操作误差，从而提高了准确度。
6结论
利用倒置式显微镜进行藻类检测和计数的方法，比使用正置式显微镜的血球计数板法水样用量少，中间环节少，准确快捷，精密度较高，在分类鉴定和计数时，操作较为方便。但该方法使用的沉样板国内尚无厂家生产，需要从国外购买。
二、改进的水中藻类检测方法
水中藻类传统的测定方法是将一定量的水样加鲁哥试剂因定，在筒型分液漏斗中进行自然沉淀，48h后，借助虹吸方法吸去上层清液，按要求浓缩定容到30—50ml，然后在镜下计数，由于固定沉降时间较长，检测结果常滞后于生产和研究，影响了及时分析和解决问题。为了解决这一问题，下文对传统的检测蚊法中的沉淀浓缩进行了改进，摸索出一种快速测定藻类的方法，测定时间缩至当天即可出结果，而且准确、可靠，适用于生产和科研检测。
1测定原理
利用测大肠菌的抽滤装置，对检测水样进行抽滤，藻类被截留在滤膜（0.35—0.65μm）上，利用滤膜对藻细胞的吸附力并不强，用少量纯水在HJ-3型电磁搅拌器上萃取4、5次就能将全部的藻细胞洗回水中。
滤膜的主要成分是硝化纤维素（CN）,可深于丙酮，而丙酮对藻细胞形状基本没影响，当滤膜遇到丙酮后会变成透明胶液，不影响镜下观察检测。
由于丙酮易挥发，滤膜变干会恢复原型，为了保证藻细胞和滤膜的湿度，考虑到丙酮和甘油的相容性，甘油的吸潮性及本身的油脂性，能使藻细胞和滤膜在较长的时间内保持湿润透明，因此，在丙酮溶剂中加了一定比例的甘油，但甘油太多，会影响滤膜的溶解。
2.实验方法
2.1抽滤萃取法
取适量水样，按100：1的量加鲁哥试剂固定，在装有滤膜的抽滤器上进行抽滤。取下滤膜，放到100ml的小烧杯里，有藻细胞的一面朝上，加5—8ml纯水；调好电磁搅拌器转速，使液体搅拌时不会向上溅出，将小烧杯放到搅拌器上转1mim左右，取洗液。
加入纯水5—8ml纯水；重复上步聚；振洗5次，定空洗液至50ml，在显微镜下记数，计算公工：
N=[(A/Ac)×（Vs/V•Va）]×n
式中，N为每升原水样中的浮游植物数量（个•J-1）；A为计数框的体积（ml）；n为计数所得藻类数目（个）。
2.2验证法
将上述实验洗净后的滤膜放入一平面皿，在空调下或热源边（不要超过40℃）使滤膜稍干燥，将滤膜放一载玻片上，加二至四滴滤膜透明液，使膜完全溶解成透明胶液，盖上盖玻片，在CHK型显微镜下观察。
此方法也可用来验证传统沉淀法中的弃液藻细胞流失情况。
3 结果及分析
取已知数量的小球藻9.643×105•1-1，按上述方法进行回收实验，结果见表1，两种方法在实际水样中的应用结果如表2所示。
传统沉淀方法精确度低，平行样相对偏关在+15％；测试时间较长，根据理论推算，最小的藻为沉时间需要60 ，我们实验静置学时间为43H,常有一些较小的藻细胞随弃液流失，而且在南方地区气温较高，藻细胞大都偏小，易发生流失现象，流失达30％以上。

抽滤萃取法能较好地阻止藻细胞流失，但由于滤敢太小，一般只能抽滤浊度10NTU以下的水，对于源水最多只能抽滤200ML左右的水量，太多则滤孔就会被堵 而难以达到抽滤效果，所以存在取水量较少，影响代表性，如有条件，滤膜孔径可取在1.5－1.8M,对于低浊度的出厂水和滤后水，则不存在这个问题，可抽滤200－300ml水量，而且能准确地反映水中残存藻细胞的数量。
传统的沉淀方法中由于染色时间较长，藻细胞和杂质均被染成褐色，在镜下观察时，影响藻细胞的分 而抽滤萃取则没有这种问题，因为藻细胞还保存着很好的原本色泽（绝大多数为绿色）和形状，较容易与水中的细菌、真菌以及低等浮游动物、颗粒、纤维等区分开来。
三、藻类叶绿素及其降解产物的测定方法

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