一种高效微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养基优化

几种常见絮凝剂絮凝效果的比较

为比较微生物絮凝剂与目前常用絮凝剂的絮凝效果,把目前常用的絮凝剂PAC、PFC和聚合硫酸铝配成一定浓度的溶液,在高岭土悬浊液中各加入1 mL,并调节pH 为7 ～8, 测定其对高岭土的絮凝率.
5852. 6　絮凝剂粗品提取将发酵液在10000 r·min- 1下离心5 min,将上清液取出, 加入1. 2 倍体积的乙醇, 在10000r·min- 1下离心5 min,取出沉淀用60%乙醇洗涤2次,冷冻干燥即得MBF233粗品.
3　结果(Results)
3. 1　菌种筛选
从活性污泥中筛选出83株菌,有絮凝活性的有12株,经过多次传代培养和纯化,得到一株分离自LB培养基中并有稳定絮凝活性的菌株MBF - 33.该菌在LB培养基中对高岭土悬浊液的絮凝率达到81. 3% ,絮体大,沉降速度快. 该菌株菌苔呈黄色,表面光滑粘稠,在600倍显微镜下观察为短杆状.
3. 2　碳源种类的选择
不同碳源条件下实验结果见表1. 从絮凝活性看,葡萄糖和蔗糖为碳源时菌种有较高的絮凝活性,淀粉和乳糖为碳源时絮凝活性较低;从菌种生长来看,葡萄糖最容易被利用,蔗糖、淀粉和乳糖不太容易被利用,甘油不能被利用. 有研究表明,某些菌株胞外多糖水解酶较少,故单糖比多糖更容易被利用(沈萍,2000). 实验结果表明,对于MBF233,葡萄糖更容易被利用同时利于絮凝剂产生. 与用葡萄糖相比,用蔗糖时菌浓度低得多,而絮凝率只是略低. 可见蔗糖不太容易被该菌利用,有利于在发酵液中保持较高的碳源浓度,故蔗糖可以作为长效碳源.
表1　碳源种类的选择
Table 1 　The choice of carbon sources
碳源种类絮凝率菌数/ (108 CFU·mL - 1 )
葡萄糖 83. 3% 4. 85
淀粉 72. 0% 2. 52
乳糖 78. 3% 2. 89
蔗糖 80. 6% 2. 30
甘油 0 0
3. 3　碳源浓度的选择
不同碳源浓度下实验结果见图1. 从絮凝率来看,以25 g·L - 1的葡萄糖作为碳源时,菌株对高岭土絮凝率最高,达到最高86. 8%;从菌种生长来看,以25 g·L - 1的葡萄糖作为碳源时菌浓度最高,过高或过低的糖浓度都不利于该菌株生长. 这是由于糖浓度过低不能提供足够的能量和物质来源;而糖浓度过高一方面会引起发酵液中渗透压过高,使细胞失水,生长受到抑制,另一方面糖浓度过高使代谢产生的葡糖酸增加,发酵液pH值降低,不利于菌株生长. 对MBF233而言, 25 g·L - 1的糖浓度为最佳浓度.

图1　葡萄糖浓度对絮凝的影响
Fig. 1　Effect of glucose concentration on flocculating activity
3. 4　复合碳源的选择
由于葡萄糖有利于细胞的生长,蔗糖可以作为长效碳源,所以选用这两者搭配为复合碳源. 实验结果见图2.

图2　复合碳源对絮凝的影响
Fig. 2　Effect of comp lex carbon source on flocculating activity
由图2可知与单一的葡萄糖和蔗糖相比,复合碳源能有效的提高絮凝率和菌浓度. 随着C葡萄糖/C蔗糖增加,菌浓度和絮凝率随之增加, 20 g·L - 1的葡萄糖和5 g·L - 1的蔗糖组成的复合碳源得到最高的絮凝率和菌浓度. 而胞外产物的积累通常需要培养
基中碳源过量,单一的速效碳源会很快被消耗,单一的长效碳源又不能得到理想的初始细胞浓度,两者都无法得到较高的产物产率. C葡萄糖/C蔗糖= 1 /4时絮凝率与菌浓度较高,证明在此条件下既能得到较好的细胞浓度,又能保持培养基中碳源过量,故能取得较好的效果.
3. 5　氮源种类的选择
采用不同种类氮源的实验结果见表2. 由表知在几种无机氮源中菌无法正常生长,表明该菌可能还需要某种只有有机氮源才有的生长因子或微量元素. 在几种有机氮源中蛋白胨能得到最高的絮凝率和菌浓度,为最佳氮源. 若应用于工业生产,便宜易得的大豆饼粉可以替代蛋白胨作为氮源.
表2　氮源种类的选择
Table 2 　The choice of nitrogen sources
氮源种类絮凝率菌浓度/ (108 CFU·mL - 1 )
蛋白胨 94. 3% 5. 77
酵母浸膏 76. 0% 3. 56
牛肉浸膏 84. 0% 5. 21
大豆饼粉 91. 7% 5. 70
玉米粉 63. 8% 5. 77
KNO3 0 0
尿素 0 0
(NH4 ) 2 SO4 0 0
3. 6　氮源浓度的选择
不同氮源浓度下实验结果见图3. 由图3可知,从絮凝率来看,以1. 5 g·L - 1蛋白胨为氮源时,所得菌株对高岭土有最好的絮凝率. 这是因为浓度过高导致C /N比降低,不利于产物积累;浓度过低不能得到理想的菌浓度,同样不利于絮凝剂产生. 从菌浓度来看,随着氮源浓度升高,菌浓度增加,可见高浓度的氮源有利于菌种生长. 氮源浓度超过3. 5g·L - 1时,菌浓度增加不多,表明此时氮源已不是生长的瓶颈. 所以对产物发酵而言1. 5 g·L - 1蛋白胨较合适;对种子培养基,考虑到成本因素3. 5 g·L - 1蛋白胨较合适.

图3　氮源用量的确定
Fig. 3　The choice of nitrogen concentration
3. 7　复合氮源的选择
采用不同复合氮源时实验结果见表3. 由表可知对于该菌种,采用复合氮源无论是絮凝活性还是菌浓度都远远低于采用蛋白胨作为单一氮源的空白样,故该菌种并不适合采用复合氮源培养.
表3　复合氮源的选择
Table3 　The choice of comp lex nitrogen sources
氮源絮凝率菌浓度/ (108 CFU·mL - 1 )
N1 58. 4% 1. 92
N2 58. 1% 2. 42
N3 38. 1% 2. 46
N4 51. 6% 2. 10
N5 92. 5% 6. 80
3. 8　无机盐的选择
在培养基中加入不同种类无机盐时实验结果见表4. 与不加入无机盐作生长因子的空白样相比,这5种无机盐都对絮凝剂的产生有少量抑制作用;NaCl、KNO3 和CaCl2 对菌生长无明显影响,(NH4 ) 2 SO4和MgSO4对菌的生长有较好的促进作用. 可能是由于这2种无机盐能提供SO2 -4 ,而SO2 -4为菌细胞内合成含硫氨基酸或某种维生素所必需(沈萍, 2000) ,故有利于该菌生长. 综合上述实验结
果,种子培养基中宜加入0. 2 g·L - 1的MgSO4.
表4　无机盐种类的选择
Table4 　The choice of salts
无机盐絮凝率菌浓度/ (108 CFU·mL - 1 )
NaCl 82. 0% 5. 54
KNO3 84. 0% 5. 22
(NH4 )2SO4 80. 0% 9. 79

MgSO4 81.0% 10. 6
CaCl2 82. 5% 5. 43
空白 95. 3% 5. 91
3. 9　pH值的选择
不同初始pH条件下实验结果见图4. 由图4知生长最适pH值在7. 5左右, pH值太高或太低均不利于该菌生长. 这是由于一方面pH值过低或过高都会引起微生物表面电荷的改变,从而不利于细胞对营养物质的吸收;另一方面pH值的改变会让有机化合物离子化,不利于有机化合物渗入细胞(郑怀礼, 2004). 对于絮凝剂的产生,最适pH值为515,此时絮凝率高达95%. 这是由于该菌产物略呈酸性,初始pH 值为5. 5 时在发酵72 h 后pH 值为512,二者pH值相近,故利于产物产生;而pH过高或过低则会对产物生成有不同程度的抑制. 在此基础上可以推测,若在对数生长期末期之前控制pH为7. 5将利于菌株的生长,在平稳期即产物的产生时期将pH值控制在5. 5将利于产物的产生,可以达到更大的絮凝剂产率.由图5知在72 h发酵后发酵液的pH值与初始

图4 pH值对絮凝率的影响
Fig. 4　The affection of pH on flocculation
pH值相比都有不同程度的降低,初始pH值越高降低越多. 这是由于一方面代谢过程中葡糖酸的增加导致pH值下降,另一方面该菌代谢产物为酸性多糖(絮凝剂粗品溶于与发酵液等量的水pH≈ 5. 3) ,故pH值有不同程度的下降.

图5 72h发酵后pH值
Fig. 5　The pH value after 72 hours’fermentation

3. 10　与几种常见絮凝剂絮凝效果的比较
实验结果如图6所示. 在絮凝剂浓度小于40 mg·L - 1范围内,微生物絮凝剂的絮凝率明显高于其它絮凝剂;当浓度超过40 mg·L- 1时,微生物絮凝剂的絮凝效果急剧下降;当浓度超过50 mg·L - 1时聚合硫酸铝絮凝能力显著提高,聚合氯化铝也有一定提高;而聚

图6　不同絮凝剂絮凝效果比较
Fig. 6　Comparison of various kinds of flocculant
丙烯酰胺的絮凝率始终较低. 可见微生物絮凝剂絮凝率更高,而且达到较高絮凝率时用量较少,同时不会造成污染,比其它絮凝剂有较大优势.